细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡，是维持机体稳态与清除异常或多余细胞的重要生理过程。在生物医学研究中，准确检测和定量凋亡细胞显得尤为关键。流式细胞术凭借其高通量、多参数、定量的优势，已成为检测细胞凋亡的金标准方法。其中，最为经典的技术便是Annexin V结合/碘化丙啶（PI）双染法。

核心原理

Annexin V能够识别早期凋亡细胞。在凋亡早期，细胞膜的磷脂酰丝氨酸（PS）会从细胞膜的内侧翻转到外侧，成为重要的“吃我”信号。Annexin V是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，对PS有着极高的亲和力，可以特异性地结合暴露在细胞膜外的PS，从而标记早期凋亡细胞。而碘化丙啶（PI）则可识别晚期凋亡及坏死细胞，作为一种核酸染料，PI无法通过完整的细胞膜，仅在细胞膜完整性丧失时进入细胞，与DNA/RNA结合发出荧光。活细胞及早期凋亡细胞（膜完整）不会被PI染色。

实验步骤

Annexin V/PI双染法示例

试剂与耗材：

• 细胞样本（处理组与对照组）
• 1x Annexin V结合缓冲液（例如：10mM HEPES, 140mM NaCl, 25mM CaCl₂, pH 7.4）
• FITC（或其他荧光素）标记的Annexin V
• 碘化丙啶（PI）溶液（工作浓度通常为1-5μg/mL）
• PBS（无钙镁）
• 胰酶（不含EDTA或低浓度EDTA）或温和细胞刮刀
• 流式管、离心机、冰、移液器及枪头

操作流程：

细胞准备与处理：将细胞接种于培养板/皿中，待其生长至合适密度后施加凋亡诱导因素（如药物、射线、饥饿等）。处理时间应根据实验目的优化（一般几小时到几天），以获得合适的凋亡比例。处理结束时，确保收集充分数量的细胞（通常≥10⁶个/样本）。

上机检测与结果解读

完成染色后1小时内，需进行流式细胞仪检测，以免影响检测结果的准确性。流式细胞分析软件会生成双参数散点图，X轴通常是Annexin V荧光强度，Y轴是PI荧光强度，依据象限划分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。

注意事项与优化技巧

检测后的细胞应尽快进行流式检测（<1小时），避免自发凋亡。所有操作步骤应轻柔进行，以免造成细胞机械损伤。建议使用不含EDTA的温和消化酶，并严格控制胰酶的消化时间。此外，确保所用的Annexin V结合缓冲液含有足够浓度的Ca²⁺。

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