荧光定量PCR（Real-time PCR）是一种利用实时监测荧光信号来定量分析DNA或RNA的技术，广泛应用于生物医疗领域。由于其具备高灵敏度、高特异性和快速定量的优点，荧光定量PCR逐渐成为了基因表达分析、病原体检测以及基因突变筛查等研究的重要工具。

技术原理

荧光定量PCR的核心在于通过在PCR扩增反应体系中添加荧光基团，从而实现对核酸分子的定量检测。该过程的基本原理是，在PCR每个循环后实时监测荧光信号，而无需进行额外的电泳或染色步骤，极大地提高了检测效率。

反应体系

在荧光定量PCR的反应体系中，除了传统的模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液外，还需添加荧光基团。根据使用的荧光化学物质，荧光定量PCR可分为两种主要类型：荧光染料法和荧光探针法。

1. 荧光染料法

荧光染料法以SYBR Green I为代表，该染料能特异性结合双链DNA。未结合时几乎不发荧光，但结合后荧光显著增强，随着PCR产物的增加，信号强度也随之增强。然而，该方法无法区分特异性与非特异性产物的扩增。

2. 荧光探针法

荧光探针法以TaqMan探针为代表，探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团。在扩增过程中，探针与目标序列杂交，Taq酶的5'外切酶活性会降解探针，将荧光基团与淬灭基团分离，增强荧光信号，只有在目标序列被扩增时才会发出荧光，显著提高了检测的特异性。

数据解读

通过荧光信号的累积，可以绘制扩增曲线，包括基线期、指数期和平台期。指数期的荧光信号与模板量呈线性关系，利用设定的荧光阈值，可以确定每个反应管的CT值（循环阈值）。CT值与起始模板量的对数成线性关系，从而实现定量分析。

定量分析

通过已知起始拷贝数的标准品制作的标准曲线，未知样品的CT值可以通过标准曲线计算出起始拷贝数。这种方法适用于绝对定量（直接计算拷贝数）和相对定量（比较不同样本间的相对表达量）。

应用优势

荧光定量PCR具备高灵敏度、强特异性、自动化程度高、结果可靠等优点，成为基因表达分析、病原体检测以及基因突变检测等应用的首选技术。作为一家生物医疗领域的领导品牌，人生就是博-尊龙凯时致力于推动相关技术的进步和应用，为科研提供更高效的解决方案。